Chimica organica per il liceo/Acidi nucleici
Introduzione
Introduzione agli Acidi Nucleici
Gli acidi nucleici sono biopolimeri presenti in tutti gli organismi viventi, che fungono da molecole essenziali per l'immagazzinamento, la trasmissione e l'espressione dell'informazione genetica. Queste complesse macromolecole sono composte da unità ripetute chiamate nucleotidi, che consistono di tre componenti principali: una base azotata, uno zucchero a cinque atomi di carbonio (ribosio o desossiribosio) e un gruppo fosfato.
Esistono due tipi principali di acidi nucleici: l'acido desossiribonucleico (DNA) e l'acido ribonucleico (RNA).
- Il DNA è il progetto genetico di un organismo, che codifica le istruzioni per la sintesi delle proteine e la regolazione delle attività cellulari. Esiste sotto forma di una doppia elica, con due filamenti complementari tenuti insieme da legami a idrogeno tra le basi azotate adenina (A) e timina (T), e guanina (G) e citosina (C).
- L'RNA, d'altra parte, svolge diversi ruoli nell'espressione genica, tra cui:
- RNA messaggero (mRNA), che trasporta l'informazione genetica dal DNA ai ribosomi per la sintesi proteica.
- RNA di trasporto (tRNA), che porta gli amminoacidi ai ribosomi durante la sintesi proteica.
- RNA ribosomiale (rRNA), che forma il nucleo strutturale e catalitico dei ribosomi.
Struttura e Funzione degli Acidi Nucleici
La struttura e la funzione degli acidi nucleici sono strettamente collegate. La sequenza delle basi azotate lungo la catena dell'acido nucleico determina il codice genetico, con ogni tripletta di basi (codone) che codifica per uno specifico amminoacido o funge da segnale per funzioni regolatorie. La capacità degli acidi nucleici di subire replicazione, trascrizione e traduzione permette la trasmissione e l'espressione fedele dell'informazione genetica da una generazione all'altra.
Oltre al loro ruolo nella genetica, gli acidi nucleici partecipano anche a vari processi cellulari, tra cui la riparazione del DNA, l'elaborazione dell'RNA e la regolazione genica. Inoltre, i progressi nella biotecnologia hanno portato alla manipolazione e all'ingegneria degli acidi nucleici per applicazioni come l'ingegneria genetica, la diagnostica molecolare e la terapia genica.
Nucleotidi e acidi nucleici
Le unità ripetute, o monomeri, che sono legate insieme per formare gli acidi nucleici sono note come nucleotidi. L'acido desossiribonucleico (DNA) di una tipica cellula di mammifero contiene circa 3 × 10⁹ nucleotidi. I nucleotidi possono essere ulteriormente scomposti in un gruppo fosfato (PO₄³⁻) e in un nucleoside, che è composto da uno zucchero aldopentoso (uno zucchero a cinque atomi di carbonio) e da una base eterociclica purinica o pirimidinica (una base contenente atomi di azoto). acidi nucleici → nucleotidi → H₃PO₄ + base azotata + zucchero pentoso
Componenti dei Nucleotidi
Lo Zucchero Pentoso
Se lo zucchero pentoso è il ribosio, il nucleotide è più specificamente chiamato ribonucleotide, e i nucleosidi risultanti sono utilizzati nell'acido ribonucleico (RNA). Se lo zucchero è il 2-desossiribosio, il nucleotide è un desossiribonucleotide, e il nucleoside è utilizzato nell'acido desossiribonucleico (DNA). Il prefisso -desossi implica che manca un ossigeno dalla posizione 2' del ribosio.
Le Basi Azotate
Le basi azotate presenti nei nucleotidi sono classificate come pirimidine o purine.
- Le pirimidine sono ammine eterocicliche con due atomi di azoto in un anello a sei membri e includono uracile (U), timina (T) e citosina (C).
- Le purine sono ammine eterocicliche costituite da un anello pirimidinico fuso con un anello a cinque membri con due atomi di azoto. L'adenina (A) e la guanina (G) sono le principali purine presenti negli acidi nucleici.
La convenzione di numerazione prevede che i numeri con un apice (') designino gli atomi dell'anello pentoso, e i numeri senza apice designino gli atomi dell'anello purinico o pirimidinico.
Nucleosidi e Nucleotidi
I nucleosidi si formano da un legame tra il C1' anomerico dello zucchero pentoso e la posizione N1 della base pirimidinica o la posizione N9 della base purinica.
L'aggiunta di un gruppo fosfato in posizione 5' di un nucleoside crea il corrispondente nucleotide. Il DNA è composto da quattro desossiribonucleotidi (Citosina, Timina, Adenina, Guanina) e l'RNA è composto da quattro ribonucleotidi (Citosina, Uracile, Adenina, Guanina).
Oltre ad essere le unità monomeriche di DNA e RNA, i nucleotidi e alcuni dei loro derivati hanno anche altre funzioni. L'adenosina difosfato (ADP) e l'adenosina trifosfato (ATP) hanno un ruolo nel metabolismo cellulare. Inoltre, numerosi coenzimi, tra cui la flavina adenina dinucleotide (FAD), la nicotinammide adenina dinucleotide (NAD⁺) e il coenzima A, contengono nucleotidi adeninici come componenti strutturali.
Struttura Primaria degli Acidi Nucleici
I nucleotidi sono uniti tra loro attraverso il gruppo fosfato di un nucleotide che si collega con un legame estere al gruppo -OH sull'atomo di carbonio 3' dell'unità di zucchero di un secondo nucleotide. Questa unità si unisce a un terzo nucleotide, e il processo si ripete per produrre una lunga catena di acido nucleico. Lo scheletro della catena è costituito da unità alternate di fosfato e zucchero (2-desossiribosio nel DNA e ribosio nell'RNA). Le basi puriniche e pirimidiniche si ramificano da questo scheletro.
Come le proteine, gli acidi nucleici hanno una struttura primaria che è definita come la sequenza dei loro nucleotidi. A differenza delle proteine, che hanno 20 tipi diversi di amminoacidi, ci sono solo 4 tipi diversi di nucleotidi negli acidi nucleici. Per le sequenze di amminoacidi, la convenzione è di scrivere gli amminoacidi partendo dall'N-terminale. Nello scrivere le sequenze di nucleotidi, la convenzione è di scrivere i nucleotidi (usando solitamente le abbreviazioni a una lettera per le basi) partendo dal nucleotide con un gruppo fosfato libero, che è noto come estremità 5' . Per il DNA, una d minuscola è spesso scritta davanti alla sequenza per indicare che i monomeri sono desossiribonucleotidi. Il nucleotide finale ha un gruppo -OH libero sull'atomo di carbonio 3' ed è chiamato estremità 3' . La sequenza dei nucleotidi nel segmento di DNA mostrato in figura sarebbe scritta 5'-dG-dT-dA-dC-3', che è spesso ulteriormente abbreviata in dGTAC o semplicemente GTAC.
Appaiamento delle basi nel DNA - Il modello Watson-Crick
Forze intermolecolari negli acidi nucleici
Gli acidi nucleici, RNA e DNA, sono coinvolti nell'immagazzinamento e nell'espressione dell'informazione genetica in una cellula. Entrambi sono polimeri di nucleotidi monomerici. Il DNA esiste nella cellula come eliche a doppio filamento, mentre l'RNA è tipicamente una molecola a singolo filamento che può ripiegarsi nello spazio 3D per formare complesse strutture secondarie (eliche a doppio filamento) e terziarie in modo simile alle proteine. Le complesse strutture 3D formate dall'RNA gli permettono di svolgere funzioni diverse dal semplice immagazzinamento di informazioni genetiche, come la catalisi. Per questo motivo, la maggior parte degli scienziati ritiene che l'RNA abbia preceduto sia il DNA che le proteine nell'evoluzione, poiché può sia immagazzinare informazioni genetiche che catalizzare reazioni chimiche.
DNA
Il DNA è un polimero, costituito da monomeri chiamati desossinucleotidi. Il monomero contiene uno zucchero semplice (il desossiribosio, mostrato in nero sopra), un gruppo fosfato (in rosso) e un gruppo R organico ciclico (in blu) che è analogo alla catena laterale di un amminoacido. Nel DNA vengono utilizzate solo quattro basi (a differenza delle 20 diverse catene laterali nelle proteine) che, per semplicità, abbrevieremo in A, G, C e T. Sono chiamate basi perché contengono gruppi amminici che possono accettare protoni. Il polimero è costituito da uno scheletro zucchero-fosfato-zucchero-fosfato, con una base legata a ciascuna molecola di zucchero. Come per le proteine, lo scheletro del DNA è polare ma anche carico. È un polianione. Le basi, analoghe alle catene laterali degli amminoacidi, sono prevalentemente polari. Data la natura carica dello scheletro, ci si potrebbe aspettare che il DNA non si ripieghi in una forma globulare (sferica) compatta, anche se cationi carichi positivamente come il Mg2+ si legano e stabilizzano la carica sul polimero. Invece, il DNA esiste solitamente come una struttura a doppio filamento (ds) con gli scheletri di zucchero-fosfato dei due diversi filamenti che corrono in direzioni opposte (uno 5'-3' e l'altro 3'-5'). I filamenti sono tenuti insieme da legami a idrogeno tra le basi su filamenti complementari. Pertanto, come le proteine, il DNA ha una struttura secondaria, ma in questo caso i legami a idrogeno non sono all'interno dello scheletro, ma tra le basi delle "catene laterali" su filamenti opposti. È in realtà improprio chiamare il dsDNA una molecola, poiché consiste in realtà di due filamenti diversi e complementari tenuti insieme da legami a idrogeno.
Nel 1950, Erwin Chargaff della Columbia University dimostrò che la quantità molare di adenina (A) nel DNA era sempre uguale a quella della timina (T). Allo stesso modo, dimostrò che la quantità molare di guanina (G) era la stessa di quella della citosina (C). Le scoperte di Chargaff indicano chiaramente che nella struttura del DNA esiste un qualche tipo di appaiamento tra le basi azotate eterocicliche. Nel DNA a doppio filamento, la base guanina (G) su un filamento può formare tre legami a idrogeno con una base citosina (C) su un altro filamento (questa è chiamata una coppia di basi GC: ). La base timina (T) su un filamento può formare due legami a idrogeno con una base adenina (A) sull'altro filamento (questa è chiamata una coppia di basi AT: ). Il DNA a doppio filamento ha una struttura geometrica regolare con una distanza fissa tra i due scheletri. Ciò richiede che le coppie di basi consistano in una base con una struttura a due anelli (biciclica), dette purine, e una con una struttura ad anello singolo, dette pirimidine. Di conseguenza, una coppia G-A o T-C non sono partner di appaiamento possibili.
Struttura secondaria del DNA
La struttura tridimensionale del DNA fu oggetto di un intenso sforzo di ricerca tra la fine degli anni '40 e l'inizio degli anni '50. Il DNA esiste come una molecola a doppio filamento che si avvolge attorno al proprio asse per formare una struttura elicoidale, stabilizzata attraverso l'appaiamento a idrogeno di Watson-Crick tra purine e pirimidine, e attraverso interazioni di impilamento pi-pi (pi-pi stacking) tra le basi disposte nella colonna elicoidale. Ogni filamento è complementare all'altro; i nucleotidi su un filamento si legano con legami a idrogeno ai nucleotidi complementari sul filamento opposto — cioè, fianco a fianco con l'estremità 5' di una catena vicino all'estremità 3' dell'altra. Le basi puriniche e pirimidiniche sono rivolte verso l'interno dell'elica, con la guanina sempre opposta alla citosina e l'adenina sempre opposta alla timina. L'"avvolgimento" a doppia elica si verifica a causa della geometria angolare di ogni nucleotide legato.
Il lavoro iniziale rivelò che il polimero di DNA aveva un pattern regolare e ripetitivo. I dati di diffrazione dei raggi X mostrano che un pattern elicoidale ripetuto è largo 20 Ångström e si ripete ogni 34 Ångström, con 10 subunità nucleotidiche per giro. Ogni subunità occupa 3,4 Ångström, che è la stessa quantità di spazio occupata da una singola unità nucleotidica. Nella maggior parte delle condizioni, i due filamenti dell'elica sono leggermente sfalsati, il che crea un solco maggiore di 12 Ångström su una faccia della doppia elica e un solco minore di 6 Ångström sull'altra. Il polimero di DNA complessivo varia in lunghezza (numero di unità zucchero-fosfato collegate), composizione delle basi (quante di ciascun tipo di base) e sequenza (l'ordine delle basi nello scheletro).
L'informazione genetica e i processi cellulari
Cosa intendiamo quando diciamo che l'informazione è codificata nella molecola del DNA? Il DNA di un organismo può essere paragonato a un libro che contiene le istruzioni per assemblare un modellino di aereo o per lavorare a maglia un maglione. Le lettere dell'alfabeto sono disposte in parole, e queste parole dirigono l'individuo a compiere determinate operazioni con materiali specifici. Se tutte le istruzioni vengono seguite correttamente, si produce un modellino di aereo o un maglione.
Nel DNA, le particolari sequenze di nucleotidi lungo le catene codificano le istruzioni per costruire un organismo. Proprio come sega significa una cosa in italiano e se la vide ne significa un'altra, la sequenza di basi CGT significa una cosa, e TGC ne significa un'altra diversa. Sebbene ci siano solo quattro lettere — i quattro nucleotidi — nel codice genetico del DNA, la loro sequenza lungo i filamenti di DNA può variare così ampiamente che l'immagazzinamento di informazioni è essenzialmente illimitato.
L'acido desossiribonucleico (DNA) immagazzina l'informazione genetica, mentre l'acido ribonucleico (RNA) è responsabile della trasmissione o dell'espressione dell'informazione genetica dirigendo la sintesi delle migliaia di proteine presenti negli organismi viventi. Ma come svolgono queste funzioni gli acidi nucleici? Sono necessari tre processi:
- Replicazione, in cui vengono prodotte nuove copie di DNA.
- Trascrizione, in cui un segmento di DNA viene utilizzato per produrre RNA.
- Traduzione, in cui l'informazione contenuta nell'RNA viene tradotta in una sequenza proteica.
Replicazione del DNA
Replicazione del DNA
Secondo il dogma centrale della genetica molecolare, il DNA è il componente geneticamente attivo dei cromosomi di una cellula. Ciò significa che il DNA nel nucleo cellulare contiene tutte le informazioni necessarie per controllare la sintesi delle proteine, degli enzimi e delle altre molecole necessarie mentre la cellula cresce, svolge il suo metabolismo e infine si riproduce. Pertanto, quando una cellula si divide, il suo DNA deve trasmettere l'informazione genetica a entrambe le cellule figlie. Deve in qualche modo essere in grado di dividersi in copie duplicate. Questo processo è chiamato replicazione. Data la struttura a doppi filamenti complementari del DNA, è relativamente facile capire come il DNA, come molecola, sia ben strutturato per la replicazione, come mostrato nella Figura 28.3.1. Ogni filamento serve da stampo per un nuovo filamento. Quindi, dopo la replicazione del DNA, ogni nuova doppia elica di DNA avrà un filamento dalla molecola di DNA originale e un filamento neosintetizzato. Questo processo è noto come replicazione semiconservativa.
La replicazione del DNA. La replicazione avviene tramite lo svolgimento parziale dei due filamenti, accompagnato dalla sintesi di un nuovo filamento complementare a ciascuno degli originali. (CC BY 4.0; Aida Khakimova, Oleg Zolotarev, e Igor Zatsman via the Open Public Health Journal)
Esiste un meccanismo piuttosto complesso per la replicazione del DNA, che coinvolge molti enzimi e fattori proteici diversi. Consideriamo alcuni degli aspetti più importanti. Innanzitutto, il doppio filamento deve essere aperto per replicare ogni filamento stampo. Per fare ciò, un insieme di proteine ed enzimi si lega e apre la doppia elica in un punto di origine nella molecola. Questo forma le forcelle di replicazione, punti in cui il DNA a doppio filamento si apre, permettendo che la replicazione avvenga. Un enzima, l'elicasi, si lega alle forcelle di replicazione con la funzione di svolgere ulteriormente il DNA e permettere alla forcella di muoversi lungo il doppio filamento man mano che il DNA viene replicato. Un altro enzima, la DNA girasi, è necessario per alleviare la tensione sul duplex causata dallo svolgimento. Inoltre, sono necessarie delle proteine leganti il singolo filamento (SSB) per impedire che i singoli filamenti si riassocino. Un altro enzima essenziale in questa fase di iniziazione è la primasi, che crea un primer a RNA su ogni singolo filamento di DNA per dare inizio alla replicazione.
Tutte queste funzioni iniziali sono necessarie per preparare il DNA per l'enzima principale che costruisce i nuovi filamenti, la DNA polimerasi. Esistono molteplici enzimi polimerasi, ma per ora ci concentreremo sulla DNA polimerasi III, la principale DNA polimerasi in E. coli. La DNA polimerasi III catalizza la reazione con cui un nuovo nucleotide viene aggiunto a un filamento di DNA in crescita. Tale reazione è mostrata nella Figura 28.3.2. Gli enzimi DNA polimerasi necessitano di un gruppo ossidrilico 3' libero (-OH) per iniziare a sintetizzare un nuovo filamento, il che spiega la necessità del primer a RNA, che fornisce un gruppo 3'-OH da cui la DNA polimerasi III può partire.
La polimerizzazione dei nucleotidi del DNA. Il gruppo ossidrilico 3' attacca il gruppo trifosfato sul nucleotide in arrivo. Si forma un nuovo legame fosfodiesterico e un gruppo pirofosfato viene rilasciato. Ciò che rimane sono due fosfati, l'energia rilasciata dalla rottura del gruppo fosfato ad alta energia e un filamento di DNA allungato con un nuovo gruppo ossidrilico 3' a cui può essere aggiunto un altro nucleotide.
Questo porta a un'altra limitazione della DNA polimerasi III. Un filamento, il filamento guida (leading strand), può essere polimerizzato in modo continuo poiché il nuovo filamento viene creato in direzione 5'→3' a partire dalla forcella di replicazione. Tuttavia, poiché i filamenti originali sono antiparalleli, l'altro filamento, il filamento in ritardo (lagging strand), va nella direzione sbagliata per la polimerizzazione. In questo caso, la reazione di polimerizzazione inizia lontano dalla forcella di replicazione e procede all'indietro verso di essa. Ciò significa che il filamento in ritardo viene sintetizzato in segmenti discontinui, noti come frammenti di Okazaki, invece che in modo continuo. Successivamente, un'altra DNA polimerasi (nel caso di E. coli, la DNA polimerasi I) rimuove i primer a RNA e riempie le discontinuità. Infine, un altro enzima, la DNA ligasi, salda le interruzioni tra i gruppi 3'-OH e i gruppi fosfato 5' nei filamenti neosintetizzati. Sebbene gli enzimi di questo processo differiscano negli eucarioti, essi svolgono meccanismi simili. Nonostante la complessità di questo processo, la DNA polimerasi III è in grado di aggiungere nuovi nucleotidi a una velocità di 250-1.000 nucleotidi al secondo.
I numerosi vantaggi della struttura a doppia elica tenuta insieme da legami a idrogeno sono evidenti nel processo di replicazione. L'appaiamento complementare delle basi, A con T e G con C, assicura che le due nuove molecole di DNA siano identiche all'originale. Il gran numero di legami a idrogeno, ciascuno dei quali è relativamente debole, rende improbabile una separazione completa dei due filamenti, ma un singolo legame a idrogeno, o anche alcuni, possono essere rotti abbastanza facilmente. La porzione elicasi del complesso di replicazione può quindi separare i due filamenti in modo molto simile a come funziona una cerniera lampo. Come i denti di una cerniera, i legami a idrogeno forniscono una grande forza quando lavorano tutti insieme, ma lo strumento giusto può separarli uno alla volta.
Diagramma schematico della replicazione del DNA. La replicazione del DNA avviene attraverso l'apertura sequenziale di segmenti della doppia elica.
La portata del problema della replicazione del DNA
I 46 cromosomi del genoma umano sono costituiti da circa 6,5 miliardi di paia di basi di DNA, se si considera l'intero genoma diploide (cioè contando il DNA ereditato da entrambi i genitori). Considerando che questo DNA può essere copiato in poche ore, si capisce che la velocità di replicazione del DNA è sbalorditiva.
Sebbene la replicazione del DNA sia tipicamente un processo molto accurato e le DNA polimerasi con capacità di correzione di bozze (proofreading) aiutino a mantenere basso il tasso di errore (circa uno ogni 10 miliardi di basi), degli errori possono comunque verificarsi. Oltre agli errori di replicazione, possono verificarsi anche danni ambientali al DNA. Tali errori non corretti o danni ambientali possono portare a conseguenze gravi. Pertanto, la natura ha evoluto diversi meccanismi per rilevare e riparare il DNA danneggiato o sintetizzato in modo errato.
Trascrizione del DNA
Trascrizione: Sintesi dell'RNA
Perché l'informazione ereditaria contenuta nel DNA sia utile, deve essere "espressa", cioè utilizzata per dirigere la crescita e il funzionamento di un organismo. Il flusso dell'informazione genetica nelle cellule va dal DNA all'mRNA fino alle proteine, attraverso geni che specificano le sequenze degli mRNA, i quali a loro volta specificano le sequenze delle proteine.
Tipi di RNA
Durante la trascrizione si formano tre tipi di RNA: RNA messaggero (mRNA), RNA ribosomiale (rRNA) e RNA di trasporto (tRNA). Questi tre tipi di RNA differiscono per funzione, dimensione e percentuale sul totale dell'RNA cellulare (Tabella 28.4.1). L'mRNA costituisce solo una piccola percentuale della quantità totale di RNA all'interno della cellula, principalmente perché ogni molecola di mRNA esiste per un tempo relativamente breve; viene continuamente degradata e risintetizzata. Le dimensioni molecolari della molecola di mRNA variano a seconda della quantità di informazione genetica che una data molecola contiene. Dopo la trascrizione, che avviene nel nucleo, l'mRNA passa nel citoplasma, portando il messaggio genetico dal DNA ai ribosomi, i siti della sintesi proteica. Vedremo in seguito come l'mRNA determini direttamente la sequenza degli amminoacidi durante la sintesi proteica.
| Tipo | Funzione | Numero approssimativo di nucleotidi | Percentuale di RNA cellulare totale |
|---|---|---|---|
| mRNA | Codifica per le proteine | 100–6.000 | ~3% |
| rRNA | Componente dei ribosomi | 120–2.900 | 83% |
| tRNA | Molecola adattatrice che porta l'amminoacido al ribosoma | 75–90 | 14% |
Il processo di trascrizione
Il primo passo nei processi che costituiscono l'espressione del DNA è la sintesi dell'RNA, tramite un meccanismo a stampo che è per molti versi analogo alla replicazione del DNA. Poiché l'RNA sintetizzato è una copia complementare dell'informazione contenuta nel DNA, la sintesi dell'RNA è definita trascrizione. La trascrizione richiede che la doppia elica del DNA si svolga parzialmente nella regione di sintesi dell'mRNA. La regione di svolgimento è chiamata bolla di trascrizione. La sequenza del DNA presenta dei pattern che indicano dove l'RNA polimerasi dovrebbe iniziare e terminare la trascrizione. Una sequenza di DNA a cui si lega l'RNA polimerasi per iniziare la trascrizione è chiamata promotore. La sequenza di DNA che indica il punto finale della trascrizione, dove l'RNA polimerasi dovrebbe smettere di aggiungere nucleotidi e dissociarsi dallo stampo, è nota come sequenza terminatore. Il promotore e il terminatore, quindi, delimitano la regione del DNA che deve essere trascritta.
Nei batteri, la sequenza del promotore contiene due regioni di 6 paia di basi (bp) chiamate sequenze consenso. Una sequenza è centrata a circa 10 bp a monte (upstream) del sito di inizio della trascrizione. La seconda sequenza si trova a circa 35 paia di basi a monte dell'inizio della trascrizione. Le sequenze consenso a -10 e -35 sono necessarie per il riconoscimento della regione del promotore da parte dell'RNA polimerasi.
La sequenza di DNA che viene trascritta per produrre RNA è chiamata filamento antisenso (detto anche stampo, anticodificante o trascritto), mentre la sequenza complementare sull'altro filamento di DNA è chiamata filamento senso (detto anche codificante o informazionale). Per iniziare la sintesi dell'RNA, i due filamenti di DNA si svolgono in siti specifici lungo la molecola. I ribonucleotidi sono attratti dalla regione di svolgimento della molecola di DNA, iniziando dall'estremità 3' del filamento stampo, secondo le regole dell'appaiamento delle basi:
- La Timina (T) nel DNA richiede l'Adenina (A) nell'RNA.
- La Citosina (C) nel DNA specifica la Guanina (G) nell'RNA.
- La Guanina (G) nel DNA richiede la Citosina (C) nell'RNA.
- L'Adenina (A) nel DNA richiede l'Uracile (U) nell'RNA.
L'RNA polimerasi — un enzima — lega il ribonucleotide complementare e catalizza la formazione del legame estere tra i ribonucleotidi, una reazione molto simile a quella catalizzata dalla DNA polimerasi. La sintesi del filamento di RNA avviene in direzione 5'→3', antiparallela al filamento stampo. Solo un breve segmento della molecola di RNA è legato con legami a idrogeno al filamento stampo in un dato momento durante la trascrizione. Una volta completata la trascrizione, l'RNA viene rilasciato e l'elica del DNA si riforma. La sequenza nucleotidica del filamento di RNA formato durante la trascrizione è identica a quella del corrispondente filamento codificante del DNA, con la differenza che la U sostituisce la T.
Diagramma schematico della trascrizione dell'RNA da uno stampo di DNA. La rappresentazione dell'RNA polimerasi è proporzionalmente molto più piccola della molecola reale, che comprende circa 50 nucleotidi alla volta.
Trascrizione negli eucarioti e complessità genica
I geni degli eucarioti (animali e piante) di solito non hanno segmenti continui di DNA codificante. Piuttosto, presentano sequenze di DNA interposte (introni) all'interno di un dato gene, che separano frammenti codificanti di DNA (esoni). In un processo chiamato splicing, viene prodotto un trascritto primario dal DNA, e poi degli complessi chiamati spliceosomi tagliano via gli introni e uniscono gli esoni per formare un tratto contiguo che costituirà l'RNA messaggero (mRNA). Una volta formato, l'mRNA lascia il nucleo per essere tradotto in una sequenza proteica.
Nuove scoperte rendono ancora più complicato definire un gene, specialmente se si studiano i trascritti di una "regione genica". Cheng et al. hanno studiato tutti i trascritti di 10 diversi cromosomi umani e 8 diverse linee cellulari. Hanno trovato un gran numero di trascritti diversi, molti dei quali si sovrapponevano. Lo splicing avveniva spesso tra introni non adiacenti. Sono stati trovati trascritti da entrambi i filamenti e provenienti da regioni contenenti sia introni che esoni. Altri studi hanno scoperto che fino al 5% dei trascritti continuava oltre la fine di un "gene", entrando in altri geni. Il 63% dell'intero genoma del topo, che è composto solo per il 2% da esoni, viene trascritto.
Traduzione dell'RNA - Biosintesi proteica
Traduzione: Dalla Sequenza Nucleotidica alla Proteina
Dopo la trascrizione, che avviene nel nucleo, l'mRNA passa nel citoplasma, portando il messaggio genetico dal DNA ai ribosomi, i siti della sintesi proteica. I ribosomi sono substrutture cellulari dove vengono sintetizzate le proteine. Contengono circa il 65% di rRNA e il 35% di proteine, tenuti insieme da numerose interazioni non covalenti, come i legami a idrogeno, in una struttura complessiva composta da due particelle globulari di dimensioni disuguali. Passiamo ora alla questione di come la sequenza di nucleotidi in una molecola di acido ribonucleico (RNA) venga tradotta in una sequenza di amminoacidi.
Il Codice Genetico
Come può una molecola contenente solo 4 nucleotidi diversi specificare la sequenza dei 20 amminoacidi presenti nelle proteine? Se ogni nucleotide codificasse per 1 amminoacido, allora ovviamente gli acidi nucleici potrebbero codificare solo per 4 amminoacidi. E se gli amminoacidi fossero codificati da gruppi di 2 nucleotidi? Ci sono 42, ovvero 16, diverse combinazioni di 2 nucleotidi (AA, AU, AC, AG, UU, e così via). Un codice del genere è più esteso ma non ancora adeguato a codificare per 20 amminoacidi. Tuttavia, se i nucleotidi sono disposti in gruppi di 3, il numero di diverse combinazioni possibili è 43, ovvero 64. Qui abbiamo un codice sufficientemente esteso da dirigere la sintesi della struttura primaria di una molecola proteica.
Il codice genetico può quindi essere descritto come l'identificazione di ciascun gruppo di tre nucleotidi e del suo particolare amminoacido. La sequenza di questi gruppi a triplette nell'mRNA detta la sequenza degli amminoacidi nella proteina. Ogni singola unità di codifica di tre nucleotidi, come abbiamo visto, è chiamata codone.
Il Codice Genetico
I primi ricercatori si trovarono di fronte al compito di determinare quale dei 64 possibili codoni corrispondesse a ciascuno dei 20 amminoacidi. La decifrazione del codice genetico fu il risultato congiunto di diversi genetisti di fama — in particolare Har Khorana, Marshall Nirenberg, Philip Leder e Severo Ochoa — tra il 1961 e il 1964. Il dizionario genetico che compilarono, riassunto nella Figura 28.5.3, mostra che 61 codoni codificano per amminoacidi, e 3 codoni servono come segnali per la terminazione della sintesi polipeptidica (in modo simile al punto alla fine di una frase). Si noti che solo la metionina (AUG) e il triptofano (UGG) hanno un singolo codone. Tutti gli altri amminoacidi hanno due o più codoni.
Il Processo di Sintesi Proteica (Traduzione)
La sintesi proteica si realizza attraverso interazioni ordinate tra l'mRNA e gli altri acidi ribonucleici (RNA di trasporto [tRNA] e RNA ribosomiale [rRNA]), il ribosoma e più di 100 enzimi. L'mRNA formato nel nucleo durante la trascrizione viene trasportato attraverso la membrana nucleare nel citoplasma fino ai ribosomi, portando con sé le istruzioni genetiche. Il processo in cui l'informazione codificata nell'mRNA viene utilizzata per dirigere la sequenza degli amminoacidi e quindi, in ultima analisi, per sintetizzare una proteina, è definito traduzione.
Prima che un amminoacido possa essere incorporato in una catena polipeptidica, deve essere legato al suo specifico tRNA. Il gruppo acido carbossilico dell'amminoacido forma un legame estere con il gruppo ossidrilico 3' sul ribosio legato all'estremità 3' del tRNA. Questo processo cruciale richiede un enzima noto come amminoacil-tRNA sintetasi (Figura 28.5.1). Esiste una specifica amminoacil-tRNA sintetasi per ogni amminoacido. Questo alto grado di specificità è vitale per l'incorporazione dell'amminoacido corretto in una proteina. Dopo che la molecola di amminoacido è stata legata al suo trasportatore tRNA, la sintesi proteica può avere luogo.
Legame di un Amminoacido al suo tRNA
La struttura bidimensionale di una molecola di tRNA ricorda una foglia di trifoglio. A un'estremità della molecola di tRNA si trova lo stelo accettore, dove l'amminoacido si lega. La molecola di tRNA ha tre anse distintive. Una di queste è chiamata ansa dell'anticodone, che contiene una sequenza di tre nucleotidi chiamata anticodone. Ogni anticodone corrisponde all'amminoacido che ogni molecola di tRNA è specificamente progettata per trasportare. Ad esempio, l'amminoacido lisina ha il codone AAG, quindi l'anticodone è UUC. Pertanto, la lisina sarebbe trasportata da una molecola di tRNA con l'anticodone UUC. Ciascuno dei 20 amminoacidi presenti nelle proteine ha almeno un tipo corrispondente di tRNA, e la maggior parte degli amminoacidi ne ha più di uno.
RNA di Trasporto (a) Nella struttura bidimensionale di una molecola di tRNA di lievito per la fenilalanina, l'amminoacido si lega allo stelo accettore situato all'estremità 3' della sequenza primaria del tRNA. (b) Nella struttura tridimensionale del tRNA di lievito per la fenilalanina, si noti che l'ansa dell'anticodone è in basso e lo stelo accettore è in alto a destra. (c) Questo mostra un modello space-filling del tRNA.
Durante la sintesi proteica, il codone sull'mRNA determina quale tipo di tRNA aggiungerà il suo amminoacido alla catena in crescita. Ovunque il codone AAG appaia nell'mRNA, un anticodone UUC su un tRNA si lega temporaneamente al codone. Man mano che ogni diverso tRNA porta un amminoacido in posizione, un enzima lo aggiunge alla catena proteica in crescita. La proteina viene rilasciata dal ribosoma una volta completata. La Figura 28.5.4 illustra una rappresentazione schematica e graduale di questo importantissimo processo.
Le Fasi di Allungamento nella Sintesi Proteica
Sequenziamento del DNA
Sequenziamento del DNA
Il sequenziamento del DNA determina l'ordine delle basi nucleotidiche all'interno di un dato frammento di DNA. Questa informazione può essere utilizzata per dedurre la sequenza di RNA o di proteina codificata dal gene, da cui si possono trarre ulteriori conclusioni sulla funzione del gene e sulla sua relazione con altri geni e prodotti genici. L'informazione della sequenza del DNA è utile anche per studiare la regolazione dell'espressione genica. Se il sequenziamento del DNA viene applicato allo studio di molti geni, o addirittura di un intero genoma, è considerato un esempio di genomica.
Mentre le tecniche per sequenziare le proteine esistono dagli anni '50, le tecniche per sequenziare il DNA non furono sviluppate fino alla metà degli anni '70, quando due distinti metodi di sequenziamento furono sviluppati quasi simultaneamente: uno dal gruppo di Walter Gilbert all'Università di Harvard, l'altro dal gruppo di Frederick Sanger all'Università di Cambridge. Tuttavia, fino agli anni '90, il sequenziamento del DNA era un processo relativamente costoso e lungo. L'uso di nucleotidi radiomarcati complicava inoltre il problema a causa di problemi di sicurezza. Con la tecnologia e le macchine automatizzate attualmente disponibili, il processo è più economico, più sicuro e può essere completato in poche ore. Il metodo di sequenziamento di Sanger è stato utilizzato per il progetto di sequenziamento del genoma umano, che ha terminato la sua fase di sequenziamento nel 2003, ma oggi sia questo che il metodo di Gilbert sono stati in gran parte sostituiti da metodi migliori.
Enzimi di Restrizione
Per poter sequenziare il DNA, è prima necessario tagliarlo in frammenti più piccoli. Ciò che serve è un modo per scindere la molecola di DNA in pochi siti localizzati con precisione, in modo da produrre un piccolo insieme di frammenti omogenei. Per tagliare il DNA in posizioni note, i ricercatori utilizzano gli enzimi di restrizione (o endonucleasi di restrizione), enzimi purificati da varie specie batteriche e che possono essere acquistati da diverse fonti commerciali. Le endonucleasi di restrizione (RE) si trovano naturalmente nei batteri, dove riconoscono specificamente brevi sequenze di nucleotidi nel DNA e catalizzano rotture a doppio filamento nel sito di riconoscimento o nelle sue vicinanze (noto anche come sito di restrizione).
Questi enzimi prendono solitamente il nome dal batterio da cui sono stati isolati per la prima volta. Ad esempio, EcoRI ed EcoRV sono entrambi enzimi da E. coli. Gli enzimi di restrizione come EcoRI sono spesso chiamati "6-cutters", perché riconoscono una sequenza di 6 nucleotidi. Assumendo una distribuzione casuale di A, C, G e T nel DNA, la probabilità prevede che un sito di riconoscimento per un 6-cutter si presenti circa una volta ogni 4096 paia di basi (bp) (46). Naturalmente, la distribuzione dei nucleotidi nel DNA non è casuale, quindi le dimensioni effettive dei frammenti di DNA prodotti da EcoRI variano da centinaia a molte migliaia di paia di basi, ma la dimensione media è vicina a 4000 bp. Frammenti di DNA di questa lunghezza sono utili in laboratorio, poiché sono abbastanza lunghi da contenere la sequenza codificante per le proteine e sono ben risolti su gel di agarosio.
EcoRI riconosce la sequenza G-A-A-T-T-C nel DNA a doppio filamento. Questa sequenza di riconoscimento è un palindromo con un asse di simmetria binario, perché leggendo da 5' a 3' su entrambi i filamenti dell'elica si ottiene la stessa sequenza. La natura palindromica del sito di restrizione è più evidente nella figura sottostante. EcoRI catalizza l'idrolisi dei legami fosfodiesterici tra G e A su entrambi i filamenti di DNA. I frammenti di restrizione generati nella reazione hanno corte code a singolo filamento alle estremità 5'. Queste estremità sono spesso definite estremità coesive ("sticky ends"), per la loro capacità di formare legami a idrogeno con sequenze di DNA complementari.
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La sequenza di riconoscimento per EcoRI (blu) viene tagliata dall'enzima (grigio). Questo particolare enzima taglia il DNA in una posizione sfalsata rispetto al centro del sito di restrizione. Ciò crea un'estremità sporgente e coesiva.
Lettura delle Sequenze di DNA: Il Metodo Sanger
Discuteremo un metodo per leggere la sequenza del DNA. Questo metodo, sviluppato da Sanger, gli valse un secondo premio Nobel. Il sequenziamento di Sanger, noto anche come sequenziamento a terminazione di catena, richiede un DNA stampo a singolo filamento, un primer di DNA, una DNA polimerasi, normali desossinucleotidi trifosfato (dNTP) e nucleotidi modificati (dideossinucleotidi - ddNTP) che terminano l'allungamento del filamento di DNA. Questi nucleotidi terminatori di catena mancano di un gruppo 3'-OH necessario per la formazione di un legame fosfodiesterico tra due nucleotidi, causando l'arresto dell'estensione del DNA da parte della DNA polimerasi quando un ddNTP viene incorporato.
Dideossinucleotidi
Vengono preparate quattro provette di reazione, ciascuna contenente il DNA stampo da sequenziare, un primer di sequenza nota, tutti e quattro i desossinucleotidi standard (dATP, dGTP, dCTP e dTTP) e la DNA polimerasi. A ciascuna reazione viene aggiunto solo uno dei quattro dideossinucleotidi (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP), che è stato etichettato con un marcatore fluorescente. Per la maggior parte del tempo in una reazione di sequenziamento di Sanger, la DNA polimerasi aggiungerà un dNTP normale al filamento in crescita che sta sintetizzando in vitro. Ma in posizioni casuali, aggiungerà invece un ddNTP. Quando ciò accade, quel filamento verrà terminato al ddNTP appena aggiunto. Se nella miscela di reazione sono inclusi abbastanza DNA stampo, ognuno avrà il ddNTP etichettato inserito in una diversa posizione casuale, e ci sarà almeno un DNA terminato in corrispondenza di ogni diverso nucleotide lungo la sua lunghezza, per tutto il tempo in cui la reazione in vitro può aver luogo (circa 900 nucleotidi in condizioni ottimali).
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Sequenziamento di Sanger: Diversi tipi di sequenziamento di Sanger, tutti dipendenti dall'arresto della sequenza da parte di un dideossinucleotide terminatore (barre nere).
Al termine delle reazioni, i filamenti neosintetizzati possono essere denaturati dallo stampo e quindi separati mediante elettroforesi capillare o altri metodi equivalenti. Poiché ogni banda differisce in lunghezza di un nucleotide e l'identità di quel nucleotide è nota dalla sua fluorescenza, la sequenza del DNA può essere letta semplicemente dall'ordine dei colori nelle bande successive.
I prodotti marcati fluorescentemente possono essere separati elettroforeticamente in base alla loro lunghezza.
Quando ogni frammento di diversa dimensione esce dalla colonna capillare, un laser eccita il marcatore fluorescente sul suo nucleotide terminale. Dal colore della fluorescenza risultante, un computer può tenere traccia di quale nucleotide era presente come nucleotide terminatore. Il computer tiene anche traccia dell'ordine in cui sono apparsi i nucleotidi terminatori, che è la sequenza del DNA utilizzato nella reazione originale. In pratica, la lunghezza massima della sequenza che può essere letta da una singola reazione di sequenziamento è di circa 700 bp.
Cromatogramma: Questo è un esempio dell'output di una lettura di sequenziamento di Sanger che utilizza terminatori di colorante marcati fluorescentemente. Le quattro basi del DNA sono rappresentate da colori diversi che vengono interpretati dal software per fornire la sequenza del DNA soprastante.
Il Progetto Genoma Umano (HGP)
Gli scienziati ora conoscono la sequenza di tutti i 3 miliardi di paia di basi del DNA dell'intero genoma umano. Questa conoscenza è stata ottenuta grazie al Progetto Genoma Umano (HGP), un progetto di ricerca scientifica internazionale da 3 miliardi di dollari, lanciato formalmente nel 1990. Il progetto è stato completato nel 2003, due anni prima della sua scadenza prevista di 15 anni. Determinare la sequenza dei miliardi di paia di basi che compongono il DNA umano era l'obiettivo principale dell'HGP. Un altro obiettivo era mappare la localizzazione e determinare la funzione di tutti i geni nel genoma umano. Ci sono solo circa 20.500 geni negli esseri umani. Se si utilizzassero i metodi moderni, il costo del sequenziamento del genoma umano potrebbe scendere dall'iniziale range di miliardi di dollari a 100 dollari.
Metodi di Rilevamento
Poiché i frammenti di DNA non hanno un colore rilevabile, non possono essere visualizzati direttamente nel gel. Si usano metodi alternativi. In quello descritto sopra, venivano usati ddXTP radiomarcati. Una volta eseguito il gel di sequenziamento, questo può essere essiccato e le bande visualizzate tramite autoradiografia. Una lastra a raggi X viene posta sopra il gel essiccato in un ambiente buio. Le bande radiomarcate emetteranno radiazioni che impressioneranno la pellicola a raggi X direttamente sopra le bande. La pellicola può essere sviluppata per rilevare le bande. In una tecnica più recente, il primer può essere etichettato con un colorante fluorescente. Se si usa un colorante diverso per ogni miscela di reazione, tutte le miscele possono essere caricate in un'unica corsia di un gel. Il gel può quindi essere scansionato da un laser, che rileva la fluorescenza dei coloranti, ciascuno a una diversa lunghezza d'onda.
Sintesi del DNA
Sintesi Chimica del DNA
Il DNA deve essere sintetizzato per studiare i geni, la sequenza dei genomi e per molti altri studi. Ciò avviene in due modi: tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR) e tramite la sintesi chimica. La PCR è trattata nella Sezione 28.8. Qui ci concentreremo sulla sintesi chimica di brevi segmenti di DNA, chiamati oligonucleotidi. La sintesi di oligonucleotidi è la sintesi chimica di frammenti relativamente corti di acidi nucleici, sia DNA che RNA, con una struttura chimica (sequenza) definita. La tecnica è estremamente utile nella pratica di laboratorio attuale perché fornisce un accesso rapido ed economico a oligonucleotidi su misura della sequenza desiderata.
La sintesi del DNA è più difficile della sintesi peptidica (Sezione 26-8) a causa della complessità dei monomeri nucleotidici. Sono disponibili sintetizzatori di DNA automatici e commerciali che permettono di produrre segmenti di DNA rapidamente e a basso costo. I sintetizzatori di DNA utilizzano tipicamente tecniche in fase solida simili al sintetizzatore di peptidi in fase solida di Merrifield. I nucleotidi vengono protetti e poi legati covalentemente a un supporto solido. I nucleotidi vengono accoppiati sequenzialmente alla catena oligonucleotidica in crescita, nell'ordine richiesto dalla sequenza del prodotto. Al termine dell'assemblaggio della catena, il prodotto viene rilasciato dalla fase solida in soluzione, viene quindi deprotetto e raccolto. Il verificarsi di reazioni secondarie pone dei limiti pratici alla lunghezza degli oligonucleotidi sintetici (fino a circa 200 residui nucleotidici) perché il numero di errori si accumula con la lunghezza dell'oligonucleotide da sintetizzare. I prodotti vengono spesso isolati tramite HPLC per ottenere gli oligonucleotidi desiderati ad alta purezza. Tipicamente, gli oligonucleotidi sintetici sono molecole di DNA o RNA a singolo filamento di circa 15-25 basi di lunghezza.
I Passaggi della Sintesi Chimica del DNA
La sintesi del DNA si articola in cinque passaggi:
Passo 1: Funzionalizzazione, Protezione e Ancoraggio al Supporto Solido I nucleosidi utilizzati per questa sintesi sono modificati con un agente di collegamento al gruppo ossidrilico 3' del desossiribosio. Il gruppo ossidrilico 5' dei nucleosidi è protetto con un etere di p-dimetossitritile (DMT). Anche i gruppi amminici sulle basi eterocicliche dei nucleosidi sono protetti. Le ammine delle basi adenina e citosina sono protette con gruppi benzoile. L'ammina della guanina è protetta da un gruppo isobutirrile, mentre la timina non ha gruppi amminici e quindi non necessita di protezione.
Il supporto in fase solida utilizzato per la sintesi del DNA è comunemente costituito da sfere di silice () che sono state funzionalizzate con (3-amminopropil)trietossisilano, in modo che un gruppo amminico sia disponibile per la reazione sulla superficie. Un nucleoside protetto viene accoppiato al supporto solido attraverso un legame estere con il gruppo ossidrilico 3' del nucleoside e un legame ammidico con il gruppo amminico della superficie di silice.
Passo 2: Deprotezione del Gruppo 5'-OH
La reazione con acido dicloroacetico rimuove il gruppo protettore DMT dall'ossidrile 5' del nucleoside legato alla superficie di silice. Il gruppo uscente p-dimetossitritile forma un catione dimetossitritile relativamente stabile, che è sia terziario che benzilico. La reazione procede rapidamente attraverso un meccanismo SN1.
Passo 3: Accoppiamento
Il nucleoside legato alla superficie di silice viene quindi fatto reagire con un nucleoside protetto che ha un gruppo funzionale fosforammidite [] attaccato al gruppo ossidrilico 3' del suo desossiribosio. Inoltre, uno degli atomi di ossigeno del gruppo fosforammidite è protetto con un gruppo beta-cianoetile (). I due nucleosidi vengono accoppiati in una reazione che utilizza acetonitrile come solvente aprotico polare e tetrazolo come catalizzatore amminico eterociclico. Il prodotto di questa reazione ha un gruppo funzionale fosfito [].
Passo 4: Ossidazione
Successivamente, il prodotto fosfito del passaggio precedente viene ossidato a un fosfato tramite reazione con iodio () insieme a 2,6-dimetilpiridina in una soluzione acquosa di tetraidrofurano (THF). A questo punto, ulteriori nucleosidi possono essere aggiunti ripetendo il ciclo di sintesi (1) deprotezione del DMT, (2) accoppiamento con fosforammidite e (3) ossidazione a fosfato.
Passo 5: Distacco e Deprotezione Finale
Dopo che la catena oligonucleotidica della sequenza desiderata è stata sintetizzata, il passaggio finale consiste nella rimozione di tutti i gruppi protettori e del legame con la silice tramite reazione con ammoniaca acquosa ().
La reazione a catena della polimerasi (PCR)
Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)
La reazione a catena della polimerasi (PCR) permette di utilizzare il potere della replicazione del DNA per amplificare enormemente il DNA in un breve periodo di tempo. Come sai, le cellule replicano il loro DNA prima di dividersi e, così facendo, raddoppiano la quantità di DNA della cellula. La PCR essenzialmente imita la replicazione cellulare del DNA in provetta, copiando ripetutamente il DNA bersaglio più e più volte, per produrre grandi quantità del DNA desiderato. Kary B. Mullis ricevette il Premio Nobel nel 1993 per lo sviluppo della PCR, che è ora alla base di innumerevoli studi di ricerca sulla struttura, la funzione e l'evoluzione dei geni, nonché di applicazioni in criminologia forense, diagnostica medica e altri usi commerciali.
La PCR richiede un frammento di DNA, alcuni primer (brevi oligonucleotidi sintetici la cui sequenza corrisponde a una regione che fiancheggia la sequenza bersaglio), tutti e quattro i desossinucleotidi trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), e una DNA polimerasi termostabile, la Polimerasi Taq, dall'organismo Thermophilus aquaticus (che vive nelle sorgenti termali).
La PCR viene eseguita in un ciclo ripetuto che comprende tre fasi: denaturazione dello stampo, appaiamento dei primer ed estensione dei primer.
1. Denaturazione dello Stampo
Questa fase è il primo evento del ciclo regolare e consiste nel riscaldare la reazione a 94-98°C. Ciò causa la denaturazione del DNA stampo rompendo i legami a idrogeno tra le basi complementari, producendo molecole di DNA a singolo filamento. La polimerasi Taq è termostabile, quindi non viene denaturata dall'alta temperatura necessaria per separare i filamenti del DNA stampo.
2. Appaiamento (Annealing) dei Primer
Successivamente, la soluzione viene raffreddata a 50-65°C, una temperatura che favorisce l'incontro tra sequenze di DNA complementari e la formazione di coppie di basi, un processo chiamato appaiamento o annealing. Poiché i primer sono presenti in grande eccesso, le sequenze complementari a cui si legano vengono facilmente trovate e appaiate ai primer. Questi primer dirigono la sintesi del DNA. La replicazione avverrà solo dove un primer si appaia a un filamento di DNA, poiché le DNA polimerasi richiedono un primer per iniziare la sintesi di un nuovo filamento.
3. Estensione dei Primer
La temperatura in questa fase dipende dalla DNA polimerasi utilizzata; la polimerasi Taq ha la sua temperatura di attività ottimale a 75-80°C, e comunemente si usa una temperatura di 72°C con questo enzima. In questa fase, la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA complementare al filamento stampo, aggiungendo i dNTP che sono complementari allo stampo in direzione 5'→3', condensando il gruppo 5'-fosfato dei dNTP con il gruppo 3'-ossidrile all'estremità del filamento di DNA nascente (in estensione). Al completamento di questa fase, ci sono due copie del DNA stampo.
Il nuovo DNA può quindi essere denaturato per ricominciare il ciclo. Ogni ciclo raddoppia la quantità di DNA. Utilizzando attrezzature automatizzate, ogni ciclo di replicazione può essere completato in meno di 5 minuti. Dopo 30 cicli, quella che era iniziata come una singola molecola di DNA viene amplificata in più di un miliardo di copie.